Rješenje za detekciju endotoksina u farmaceutskoj vodi

4.1.1 Prikupljanje i obrada uzoraka
- Posude za uzorkovanje: Koristite staklene boce ili epruvete bez endotoksina (sterilizirane suhom toplinom na ≥250°C duže od 30 minuta radi uklanjanja endotoksin).
- Metode uzorkovanja: ① Pročišćena voda/voda za injekcije: Otvorite ventil za uzorkovanje, pustite vodu da teče 5-10 minuta (za ispiranje cjevovoda), a zatim sakupite uzorke pod aseptičnim uslovima; ② Uzorkovanje na ključnim tačkama sistema: Uključujući izlaz rezervoara za skladištenje, kraj distributivnog cjevovoda i prednji i zadnji dio filtera, kako bi se osigurala pokrivenost cijelog vodovodnog sistema.
- Čuvanje uzorka: Čuvati na 4°C nakon sakupljanja i potpunog otkrivanja u roku od 24 sata; ako je potrebno dugotrajno skladištenje, zamrznuti na -20°C, ali nakon odmrzavanja, uzorak se mora dobro promiješati kako bi se izbjegla neravnomjerna distribucija endotoksina.

4.1.2 Priprema reagensa i instrumenata
- Reagensi: 1. KTA komplet za određivanje endotoksina (kinetička turbidimetrijska metoda, 300 testova/komplet), kataloški broj: KTA300TA.
- Instrumenti: 1. Čitač mikroploča za kinetičku inkubaciju ELx808IUBET, kataloški broj: 808IUBET; 2. Staklene epruvete za razrjeđivanje bez endotoksina; 3. Pipetori sa vrhovima bez endotoksina; 4. Mikroploče sa 96 jažica bez endotoksina; 5. Vortex mikser; 6. Stalak za epruvete.
- Tretman bez endotoksina: Sav pribor koji je u kontaktu s uzorcima i reagensima (kao što su epruvete, pipete i vrhovi pipeta) mora se sterilizirati suhom toplinom na ≥250°C duže od 30 minuta ili koristiti pribor za jednokratnu upotrebu bez pirogena za koji je potvrđeno da ne sadrži endotoksine.

4.2.1 Priprema standardne krivulje
1. Razrijedite standard endotoksina s LAL reagensnom vodom koja se isporučuje s kompletom do niza koncentracija: 10, 1, 0,1 i 0,01 EU/ml.
2. Uzmite reakcijsku ploču sa 96 jažica bez endotoksina, dodajte 100 μl standarda serijske koncentracije u svaku jažicu i postavite 3 paralelne jažice za svaku koncentraciju.
3. Dodajte 100 μl LAL reagensa u svaku jažicu, lagano promiješajte bez pokrivanja ploče i stavite je u čitač kinetičkih inkubacijskih mikroploča ELx808IUBET za inkubaciju na 37°C.
4. Očitavajte optičku gustinu (OD) na 340 nm svakih 30 sekundi tokom 60 minuta.
5. Napravite standardnu ​​krivulju koristeći formulu: log10 Y = B(log10 X) + A (gdje je Y = vrijeme reakcije (vrijeme početka), X = koncentracija endotoksina). Koeficijent korelacije (R²) mora biti ≥0,98.

4.2.2 Detekcija uzorka
1. Dodajte 100 μl uzorka u jažice reakcijske ploče (postavite 2 paralelne jažice za svaki uzorak i 2 jažice za slijepu probu; dodajte 100 μl LAL reagensne vode u svaku jažicu za slijepu probu).
2. Ponovite korake 3 i 4 u odjeljku "Priprema standardne krivulje" iznad kako biste dinamički izmjerili apsorbanciju uzoraka.
3. Izračunajte koncentraciju endotoksina u uzorku na osnovu standardne krive.

4.2.3 Test interferencije (korak provjere ključa)
Budući da farmaceutska voda može sadržavati tvari koje ometaju LAL reakciju (kao što su rezidualni deterdženti i metalni ioni), test interferencije mora se provesti za svaku seriju uzoraka ili nakon dezinfekcije sistema:
1. Podijelite uzorak u dvije grupe: jedna grupa je obogaćena poznatom koncentracijom standarda endotoksina (obogaćena grupa), a druga grupa nije (grupa uzorka).
2. Odvojeno detektirajte koncentraciju endotoksina u dvije grupe i izračunajte "brzinu oporavka" (Brzina oporavka = [(Koncentracija grupe s dodanim endotoksinom - Koncentracija grupe uzorka) / Koncentracija s dodanim endotoksinom] × 100%).
3. Stopa oporavka u rasponu od 50%-200% ukazuje na odsustvo interferencije; ako prelazi ovaj raspon, interferencija se mora eliminirati razrjeđivanjem uzorka, podešavanjem pH vrijednosti (na 6,0-8,0) ili korištenjem inhibitora interferencije.

1. Procjena rezultata: ① Ako je koncentracija endotoksina u uzorku ≤ granice odgovarajućeg kvaliteta vode (npr. ≤0,25 EU/ml za vodu za injekcije) i test interferencije je kvalifikovan, uzorak se ocjenjuje kao "kvalifikovan"; ② Ako koncentracija prelazi granicu ili test interferencije nije kvalifikovan, potrebno je ponovno uzorkovanje i detekcija. Ako je rezultat i dalje nekvalifikovan, mora se pokrenuti istraga o odstupanju.

2. Sadržaj izvještaja: Mora sadržavati broj uzorka, mjesto uzorkovanja, datum detekcije, metodu detekcije, broj serije reagensa, parametre standardne krive, koncentraciju uzorka, rezultate testa interferencije, zaključak procjene i potpis detektora, kako bi se osigurala sljedivost izvještaja.